賽默飛3500分析儀器設置

詳情

賽默飛3500系列遺傳分析儀器設置詳解

一、前言

Applied Biosystems 3500 和 3500xL 遺傳分析儀是賽默飛公司推出的基于毛細管電泳技術的高性能DNA片段分析平臺。其廣泛應用于法醫學、群體遺傳學、分子生物學、微生物研究和個體識別等領域，以操作自動化程度高、結果重復性好、信號穩定清晰著稱。

正確設置3500分析儀是確保實驗順利進行和獲得高質量結果的基礎。儀器初裝調試、運行參數設定、數據采集方法配置、光譜矩陣校準、模板建立、運行文件編制等每一個環節都需精準操作。本文將圍繞設備結構、系統組件、參數配置、校準方法、運行模塊、分析模板、常見問題設定等方面，對賽默飛3500分析儀的完整設置流程進行系統性闡述。

二、設備組成概覽

在設置前，用戶應熟悉設備的核心硬件結構及相關部件功能：

電泳模塊（Capillary Array）：8或24通道毛細管，負責DNA片段的電泳分離。
激光檢測系統：采用固態激光激發多色熒光染料。
CCD探測器：接收熒光信號并轉換為數字圖像數據。
自動進樣系統：控制樣本的吸取與注入。
聚合物泵送系統：將POP聚合物注入毛細管以維持電泳環境。
溫控系統：控制毛細管運行環境溫度（一般為60℃）。
廢液系統：收集聚合物與電泳殘液。
用戶界面與運行軟件：Data Collection、GeneMapper、SeqScanner等。

三、系統初始化與配置前準備

1. 環境要求

溫度：20~25℃；
濕度：≤60%；
電源：220V/50Hz，具備UPS；
避免陽光直射、強磁干擾。

2. 設備檢查

檢查聚合物瓶、電泳緩沖液、廢液瓶是否安裝正確；
檢查毛細管陣列安裝是否到位；
樣本盤位置對準，檢查自動進樣托盤是否平穩；
軟件系統連接狀態無誤，儀器主界面無報警標志。

四、儀器設置流程總覽

賽默飛3500分析儀的完整設置主要包括以下幾個步驟：

新建儀器模板與運行模塊
光譜校準（Spectral Calibration）
空間校準（Spatial Calibration）
儀器設置參數配置
樣本文件與運行文件創建
分析方法模板（Analysis Method）配置
數據路徑與項目管理設置
質量控制參數設定

五、儀器模板與運行模塊配置

1. 運行模塊（Run Module）設置內容：

毛細管電壓：通常設置在13.5kV–15kV之間；
進樣電壓/時間：例如1.2kV/15秒（依試劑盒說明書）；
運行時間：按目標片段大小選擇，如1200秒用于≤500bp片段；
溫度控制：默認設定為60℃；
緩沖液類型：與試劑盒匹配，如使用Hi-Di Formamide；
Dye Set選擇：如Dye Set J、G5、D等，匹配染料組合。

可根據實驗目的（STR分析、測序、片段分析）設定不同的運行模塊并命名保存。

六、光譜矩陣校準（Spectral Calibration）

1. 校準目的

分離不同熒光染料通道，避免信號重疊，確保每種染料信號被正確識別。

2. 校準流程

使用Spectral Calibration標準品（如 DS-33 或 DS-30）；
設置染料類型與使用通道；
運行光譜采集程序；
軟件自動計算色譜矩陣；
保存并應用校準結果。

建議每兩個月或更換毛細管、電泳緩沖液、染料種類后重新校準。

七、空間校準（Spatial Calibration）

1. 校準目的

確保多通道毛細管在CCD上對應的檢測位置一致，避免峰錯位。

2. 操作流程

插入空間校準板；
運行空間校準模塊；
檢查圖像文件是否穩定、對稱；
若失敗，檢查進樣臂移動軌跡和通道潔凈度。

建議每季度進行一次，或在更換毛細管后執行。

八、分析方法與模板建立

1. Analysis Method設置

Basecaller：用于Sanger測序；
Sizing Method：用于片段大小計算；
Peak Detection：設置最低峰值強度閾值；
Baseline Window：定義基線范圍，如51點移動平均；
Size Standard設置：如LIZ500、LIZ600等；
Ladder or Standard Migration Correction：執行遷移率修正。

2. 數據路徑配置

設置樣本數據的存儲目錄；
每個項目建立獨立文件夾便于數據管理；
可啟用自動命名規則提高追蹤性。

九、樣本文件與運行文件創建

1. Sample Sheet文件

包含以下字段：

樣本編號；
樣本位置信息（A01–H12）；
分析方法模板名稱；
使用染料類型與Size Standard名稱；
Project名稱與數據保存路徑。

2. Plate文件創建

指定樣本文件所用樣本板類型（96孔或384孔）；
與樣本工作表對應；
選擇運行模塊；
命名該次運行并保存。

創建完成后在儀器主界面選擇該運行任務，確認無誤后啟動分析。

十、質量控制參數設置

1. Signal Intensity設置

建議將最小峰高設置為100–150 RFU；
峰寬限制在7–20數據點之間；
建議開啟“Pull-Up”檢測以排除染料串擾。

2. 重復樣本驗證

每次分析包含一個重復樣本；
檢查峰值遷移位置是否一致；
若出現≥0.3 bp偏差，可能存在溫控異常或毛細管堵塞。

十一、常見設置錯誤與處理建議

錯誤現象	原因分析	處理方法
無峰值輸出	樣本濃度不足、進樣失敗、設置錯誤	檢查進樣電壓、樣本制備濃度、毛細管狀態
峰值高度偏低	激光能量下降、染料降解	執行光譜校準、檢查熒光探測系統
內標未識別	Size Standard設置錯誤或通道錯配	檢查樣本模板與染料設置是否匹配
峰值拖尾、基線不穩	聚合物老化或毛細管殘留	更換聚合物、清洗毛細管或更換通道
樣本板位置與運行文件不一致	Plate設置與實際操作不符	修改樣本位置信息，或重新生成文件